Трансгенные кролики с генами гранулоцит-колониестимулирующего фактора человека и зеленого флуоресцирующего белка

Гранулоцит-колониестимулирующий фактор человека (GCSF, ГКСФ) – один из белков фармакологического назначения, который может быть выделен из молока трансгенных (ТГ) животных. Была получена плазмида, содержащая ген GCSF человека под контролем регуляторных элементов гена β-лактоглобулина крупного рогатого скота, и ген репортерного зеленого флуоресцентного белка (ЕGFP) под цитомегаловирусным (cmv) промотором. Использование выбранных промоторов обеспечивает тканеспецифичную экспрессию целевого белка в молочной железе ТГ животного-продуцента и высокий уровень ранней экспрессии репортерного белка в клетках эукариот, что позволяет детектировать ТГ эмбрионы на стадии культивирования и производить их предымплантационный отбор. Тестирование конструкции для оценки ее эффективности проводили на ТГ кроликах, полученных методом микроинъекции в мужской пронуклеус зигот. Был сделан вывод о токсичности GFP для эмбрионов на ранних стадиях развития из-за чрезмерной экспрессии гена EGFP под сильным cmv промотором. Была получена ТГ крольчиха (F0), у которой методом ИФА был оценен уровень ГКСФ человека в молоке и сыворотке крови. Из 22 крольчат, полученных от нее за четыре окрола, два были трансгенны. От ТГ самца F0 было получено потомство (F1), 56 % которого составляли самцы, из них 88 % были ТГ и по состоянию здоровья не отличались от обычных кроликов. Среди самок ТГ было 10 %, и они погибали в течение двух недель после рождения.

1. Kues, W. A. Advances in farm animal transgenesis / W. A. Kues, H. Niemann // Preventive Veterinary Medicine. – 2011. – Vol. 102, № 2. – P. 146–156. https://doi.org/10.1016/j.prevetmed.2011.04.009

2. The transgenic animal platform for biopharmaceutical production / L. R. Bertolini, H. Meade, C. R. Lazzarotto [et al.] // Transgenic Research. – 2016. – Vol. 25, № 3. – P. 329–343. https://doi.org/10.1007/s11248-016-9933-9

3. Transgenic rabbits for the production of biologically-active recombinant proteins in the milk / F. O. Castro, J. Limonta, A. Rodrıguez [et al.] // ́ Genetic Analysis: Biomolecular Engineering. – 1999. – Vol. 15, № 3–5. – P. 179–187. https://doi.org/10.1016/s1050-3862(99)00024-8

4. Трансгенные и нокаутные кролики в биомедицине и генотерапии. CRISPR/Cas9-технологии (обзор) / Е. М. Колоскова, В. Н. Каркищенко, В. А. Езерский [и др.] // Биомедицина. – 2019. – Т. 15, № 4. – P. 12–33. https://doi.org/10.33647/2074-5982-15-4-12-33

5. Mechanisms of hemostimulating effects of granulocytic CSF and pantohematogen under conditions of cytostatic myelosuppression / L. A. Miroshnichenko, V. V. Shdanov, G. N. Zyuz’kov [et al.] // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. – 2011. – Vol. 150, № 6. – P. 702–706. https://doi.org/10.1007/s10517-011-1228-9

6. Possibilities of using granulocyte colony-stimulating factor in reproductive medicine. A literature review / C. T. Nguyen, D. A. Niauri, N. I. Tapilskaya, A. М. Gzgzyan // Journal of Obstetrics and Women’s Diseases. – 2021. – Vol. 70, № 2. – P. 119–128. https://doi.org/10.17816/JOWD43587

7. Metcalf, D. Biochemistry of the colony-stimulating factors / D. Metcalf, N. A. Nicola // The hematopoietic colonystimulating factors. From biology to clinical applications / D. Metcalf, N. A. Nicola. – Cambridge [etc.], 1995. – P. 44–64. https://doi.org/10.1017/cbo9780511663376.005

8. Скрыпник, К. А. Человеческий гранулоцитарный колониестимулирующий фактор в клинической практике / К. А. Скрыпник, В. С. Косоруков // Российский биотерапевтический журнал. – 2011. – T. 10, № 2. – С. 19–24.

9. Биоаналоговые (биоподобные) лекарственные препараты рекомбинантного гранулоцитарного-колониести мули рующего фактора. Оценка качества / Ж. И. Авдеева, А. А. Солдатов, Н. А. Алпатова [и др.] // Биопрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. – 2015. – № 1 (53). – С. 4–14.

10. Production of biologically active human granulocyte colony stimulating factor in the milk of transgenic goat / J. H. Ko, Ch.-S. Lee, K. H. Kim [et al.] // Transgenic Research. – 2000. – Vol. 9, № 3. – P. 215–222. https://doi.org/10.1023/a:1008972010351

11. Секреция биологически активного гранулоцит колониестимулирующего фактора (Г-КСФ) человека в молоке трансгенных мышей / Г. А. Дворянчиков, И. А. Серова, Л. Е. Андреева [и др.] // Генетика. – 2005. – Т. 41, № 10. – С. 1330–1337.

12. A 3,387 bp 5′-flanking sequence of the goat alpha-S1-casein gene provides correct tissue-specific expression of human granulocyte colony-stimulating factor (hG-CSF) in the mammary gland of transgenic mice / I. A. Serova, G. A. Dvoryanchikov, L. E. Andreeva [et al.] // Transgenic Research. – 2012. – Vol. 21, № 3. – P. 485–498. https://doi.org/10.1007/s11248-011-9547-1

13. The establishment of two transgenic goat lines for mammary gland hG-CSF expression / V. J. F. Freitas, I. A. Serova, R. R. Moura [et al.] // Small Ruminant Research. – 2012. – Vol. 105, № 1–3. – P. 105–113. https://doi.org/10.1016/j.smallrumres.2012.03.009

14. Bovine alpha s1-casein gene sequences direct highlevel expression of human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor in the milk of transgenic mice / M. Uusi-Oukari, J.-M. Hyttinen, V.-P. Korhonen [et al.] // Transgenic Research. – 1997. – Vol. 6, № 1. – P. 75–84. https://doi.org/10.1023/a:1018461201385

15. Expression of the human granulocyte-macrophage colony stimulating factor (hGM-CSF) gene under control of the 5′-regulatory sequence of the goat alpha-S1-casein gene with and without a MAR element in transgenic mice / I. A. Burkov, I. A. Serova, N. R. Battulin [et al.] // Transgenic Research. – 2013. – Vol. 22, № 5. – P. 949–964. https://doi.org/10.1007/s11248-013-9697-4

16. Самойлов, А. В. Получение трансгенных кур с геном гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека методом опосредованного генного переноса с помощью сперматозоидов / А. В. Самойлов, А. З. Кесян, Н. М. Сураева // Известия Российской академии наук. Серия биологическая. – 2013. – № 5. – С. 517–521. https://doi.org/10.7868/S0002332913040140

17. Noninvasive fluorescent screening of microinjected bovine embryos to predict transgene integration / S. J. Rosochacki, L. Kozikova, M. Korwin-Kossakowski [et al.] // Folia Biologica. – Krakow, 2003. – Vol. 51, № 1–2. – P. 97–104.

18. Efficient selection of transgenic mouse embryos using EGFP as a marker gene / M. Kato, K. Yamanouchi, M. Ikawa [et al.] // Molecular Reproduction and Development. – 1999. – Vol. 54, № 1. – P. 43–48. https://doi.org/10.1002/(sici)10982795(199909)54:1<43::aid-mrd6>3.0.co;2-n

19. Zimmer, M. GFP: from jellyfish to the Nobel prize and beyond / M. Zimmer // Chemical Society Reviews. – 2009. – Vol. 38, № 10. – P. 2823–2832. https://doi.org/10.1039/b904023d

20. New Wistar Kyoto and spontaneously hypertensive rat transgenic models with ubiquitous expression of green fluorescent protein / A. I. Garcia-Diaz, B. Moyon, P. M. Coan [et al.] // Disease Models & Mechanisms. – 2016. – Vol. 9, № 4. – P. 463–471. https://doi.org/10.1242/dmm.024208

21. Effect of hormone modulations on donorderived spermatogenesis or colonization after syngeneic and xenotransplantation in mice / G. Shetty, Z. Wu, T. N. A. Lam [et al.] // Andrology. – 2019. – Vol. 7, № 2. – P. 257–265. https://doi.org/10.1111/andr.12571

22. Early tissue formation on whole-area osteochondral defect of rabbit patella by covering with fibroin sponge / E. Hirakata, N. Tomita, Y. Tamada [et al.] // Journal of Biomedical Materials Research. Part B: Applied Biomaterials. – 2016. – Vol. 104, № 7. – P. 1474–1482. https://doi.org/10.1002/jbm.b.33656

23. Transposon-mediated transgenesis, transgenic rescue, and tissue-specific gene expression in rodents and rabbits / K. Katter, A. M. Geurts, O. Hoffmann [et al.] // The FASEB Journal. – 2013. – Vol. 27, № 3. – P. 930–941. https://doi.org/10.1096/fj.12-205526

24. Establishment and characterization of CAG/EGFP transgenic rabbit line / R. Takahashi, T. Kuramochi, K. Aoyagi [et al.] // Transgenic Research. – 2007. – Vol. 16, № 1. – P. 115–120. https://doi.org/10.1007/s11248-006-9043-1

25. Murakami, T. GFP-transgenic animals for in vivo imaging: rats, rabbits, and pigs / T. Murakami, S. Kobayashi // In vivo cellular imaging using fluorescent proteins: methods and protocols / ed. R. M. Hoffman. – New York, 2012. – P. 177–189. – (Methods in Molecular Biology; vol. 872). https://doi.org/10.1007/978-1-61779-797-2_12

26. Езерский, В. А. Создание генно-инженерной конструкции, содержащей структурный ген GCSF человека под контролем регуляторных элементов гена β-лактоглобулина крупного рогатого скота / В. А. Езерский, Л. Б. Иванова, В. Г. Шевченко // Проблемы биологии продуктивных животных. – 2007. – № 1. – C. 123–131.

27. Генетическая конструкция, включающая кодирующую последовательность Г-КСФ человека с регуляторными областями гена β-лактоглобулина КРС и репортерный ген EGFP / В. А. Езерский, Е. М. Колоскова, Т. П. Трубицина [и др.] // Проблемы биологии продуктивных животных. – 2018. – № 3. – С. 35–44. https://doi.org/10.25687/1996-6733.prodanimbiol.2018.3.35-44

28. Chrenek, P. Quality of transgenic rabbit embryos with different EGFP gene constructs / P. Chrenek, M. Bauer, A. V. Makarevich // Zygote. – 2011. – Vol. 19, № 1. – P. 85–90. https://doi.org/10.1017/S0967199410000109

29. A very strong enhancer is located upstream of an immediate early gene of human cytomegalovirus / M. Boshart, F. Weber, G. Jahn [et al.] // Cell. – 1985. – Vol. 41, № 2. – P. 521–530. https://doi.org/10.1016/s0092-8674(85)80025-8

30. Birch, J. R. Antibody production / J. R. Birch, A. J. Racher // Advanced Drug Delivery Reviews. – 2006. – Vol. 58, № 5–6. – P. 671–685. https://doi.org/10.1016/j.addr.2005.12.006

31. Khan, K. H. Gene expression in Mammalian cells and its applications / K. H. Khan // Advanced Pharmaceutical Bulletin. – 2013. – Vol. 3, № 2. – P. 257–263. https://doi.org/10.5681/apb.2013.042

32. Lipták, N. GFP transgenic animals in biomedical research: a review of potential disadvantages / N. Lipták, Z. Bősze, L. Hiripi // Physiological Research. – 2019. – Vol. 68, № 4. – P. 525–530. https://doi.org/10.33549/physiolres.934227

33. Серов, О. Л. Трансгенные животные: фундаментальные и прикладные аспекты / О. Л. Серов // Вавиловский журнал генетики и селекции. – 2013. – Т. 17, № 4/2. – С. 1055–1064.

34. Эффективность интеграции гена лактоферрина человека в геном мыши и кролика / С. И. Тевкин, М. С. Шишиморова, В. А. Езерский [и др.] // Сельскохозяйственная биология. – 2009. – Т. 44, № 2. – C. 55–61.