Конструирование специфичных праймеров для идентификации подвидов Leuconostoc mesenteroides

Бактерии р. Leuconostoc – важная в технологическом отношении группа молочнокислых бактерий, входящая в состав заквасочных культур для производства различных молочных продуктов. В молочной промышленности наибольшее значение имеют два вида: Leuconostoc lactis и Leuconostoc mesenteroides, они включают три подвида: dextranicum, mesenteroides, cremoris. Основная проблема идентификации представителей р. Leuconostoc состоит в том, что данные микроорганизмы часто могут быть ошибочно идентифицированы как энтерококки или лактобактерии. По сравнению с традиционными способами видовой детекции установление видовой принадлежности с помощью ПЦР отличается универсальностью, более глубоким уровнем видовой дифференциации, высокой воспроизводимостью и достоверностью. В статье представлены результаты конструирования праймеров, специфичных для бактерий Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides и Leuconostoc mesenteroides ssp. dextranicum. Специфичность разработанных праймеров подтверждена тестированием in silico с использованием доступных геномных последовательностей Leuconostoc mesenteroides и экспериментально с использованием образцов ДНК чистых культур Leuconostoc mesenteroides. С помощью разработанных праймеров установлена таксономическая принадлежность 5 изолятов лейконостоков, выделенных из природных образцов. Разработаны методические указания, регламентирующие процедуру определения таксономического положения бактерий р. Leuconostoc до подвида. Методические указания по идентификации лейконостоков будут использоваться в коллекциях промышленных микроорганизмов для точной идентификации депонируемых штаммов.

1. Хусаинов, И. А. Современные представления о биосинтезе бактериальных экзополисахаридов / И. А. Хусаинов // Вестн. Казан. технол. ун-та. – 2014. – Т. 17, № 5. – С. 167–172.

2. Степаненко, П. П. Микробиология молока и молочных продуктов / П. П. Степаненко – Сергиев Посад : Все для Вас – Подмосковье, 1999. – 415 с.

3. Bergey’s manual of systematic bacteriology. – 2 nd ed. – New York : Springer, 2012. – Vol. 5 : The Actinobacteria / ed.: W. Whitman [et al.]. – 2083 p. https://doi.org/10.1007/978-0-387-68233-4.

4. Rosi, N. L. Nanostructures in biodiagnostics / N. L. Rosi, C. A. Mirkin // Chem. Rev. – 2005. – Vol. 105, N 4. – P. 1547– 1562. https://doi.org/10.1021/cr030067f

5. The atmospheric and room-temperature plasma (ARTP) method on the dextranase activity and structure / X. Wang [et al.] // Intern. J. of Biol. Macromolecules. – 2014. – Vol. 70 – P. 284 –291. https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2014.07.006

6. Otts, D. R. Dextransucrase secretion in Leuconostoc mesenteroides depends on the presence of a transmembrane proton gradient / D. R. Otts, D. F. Day // J. of Bacteriology. – 1988. – Vol. 170, N 11. – P. 5006–5011. https://doi.org/10.1128/jb.170.11.5006-5011.1988

7. Erten, H. Fermentation of glucose and fructose by Leuconostoc mesenteroides / H. Erten // Tur. J. of Agriculture a. Forestry. – 2000. – Vol. 24, № 4. – P. 527–532.

8. Гудков, А. В. Сыроделие: технологические, биологические и физико-химические аспекты / А. В. Гудков ; под ред. С. А. Гудкова. – М. : ДеЛи принт, 2003. – 799 с.

9. Carbon dioxide production by Leuconostoc mesenteroides grown in single and mixed culture with Lactococcus lactis in skimmed milk / M. Kihal [et al.] // World J. of Dairy a. Food Sciences. – 2007. – Vol. 2, N 2. – P. 62–68.

10. Шергин, Н. А. Улучшение качества сыров группы голландского путем совершенствования отбора лейконостоков в закваски : дис. ... канд. тех. наук : 05.18.04 / Н. А. Шергин. – Углич, 1985. – 246 л.

11. Dundar, H. Purification and characterization of a bacteriocin from an oenological strain of Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris / H. Dundar, B. Salih, F. Bozoğlu // Preparative Biochemistry a. Biotechnology. – 2016. – Vol. 46, N 4. – P. 354–359. https://doi.org/10.1080/10826068.2015.1031395

12. Characterization and purification of mesentericin Y105, an anti-Listeria bacteriocin from Leuconostoc mesenteroides / Y. Hechard [et al.] // J. of General Microbiology. – 1992. – Vol. 138, N 12. – P. 2725 –2731. https://doi.org/10.1099/00221287-138-12-2725

13. Aziz, R. A. Antibacterial effect of bacteriocin from Leuconostoc mesenteroides ssp. cremoris against diarrheal causative bacteria / R. A. Aziz, J. A. S. Salman, O. A. H. Hachim // ‏Europ. J. of Biomed. a. Pharmaceutical Sciences. – 2016. – Vol. 3, N 11. – P. 114–118.

14. Сорокина, Н. П. Производство ферментированных молочных продуктов и сыров: состав и свойства заквасочной микрофлоры / Н. П. Сорокина, И. В. Кучеренко // Молоч. пром-сть. – 2013. – № 6. – С. 38–40.

15. Сорокина, Н. П. Бактериальные закваски для производства сыров / Н. П. Сорокина, Е. В. Кураева, И. В. Кучеренко // Сыроделие и маслоделие. – 2016. – № 4. – С. 26–31.

16. Биологические свойства лактобацилл. Перспективы использования в лабораториях Роспотребнадзора экспресс-методов амплификации нуклеиновых кислот (МАНК) при контроле качества пищевых продуктов, БАД к пище, лекарственных форм, содержащих лактобациллы / И. В. Соловьева [и др.] // МедиАль. – 2014. – № 2 (12). – С. 29–44.

17. Точилина, А. Г. Биохимическая и молекулярно-генетическая идентификация бактерий рода Lactobacillus : дис. … канд. биол. наук : 03.00.04 ; 03.00.07 / А. Г. Точилина. – Н. Новгород, 2009. – 148 л.

18. Chentouf, H. F. Isolation and identification of Leuconostoc mesenteroides producing bacteriocin isolated from Algerian raw camel milk / H. F. Chentouf, B. Zineb // Afr. J. of Microbiology Research. – 2013. – Vol. 7, N 23. – P. 2961–2969. https://doi.org/10.5897/ajmr2013.5753

19. Dimic, G. Characteristics of the Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides strains from fresh vegetables / G. Dimic // Acta Periodica Technologica. – 2006. – N 37. – P. 3–11. https://doi.org/10.2298/apt0637003d

20. De Man, J. C. A medium for the cultivation of Lactobacilli / J. C. De Man, M. Rogosa, M. E. Sharpe // J. of Appl. Bacteriology. – 1960. – Vol. 23, N 1. – P. 130–135. https://doi.org/10.1111/j.1365-2672.1960.tb00188.x

21. Length and sequence heterogeneity in 5S rDNA of Populus deltoides / M. S. Negi [et al.] // Genome. – 2002. – Vol. 45, N 6. – P. 1181–1188. https://doi.org/10.1139/g02-094

22. Marmiroli, N. Advanced PCR techniques in identifying food components / N. Marmiroli, C. Peano, E. Maestri // Food authenticity and traceability / ed. M. Lees. – Boca Raton ; Cambridge, 2003. – P. 3–33. https://doi.org/10.1533/9781855737181.1.3

23. A genus-specific PCR method for differentiation between Leuconostoc and Weissella and its application in identification of heterofermentative lactic acid bacteria from coffee fermentation / U. Schillinger [et al.] // FEMS Microbiology Letters. – 2008. – Vol. 286, N 2. – P. 222–226. https://doi.org/10.1111/j.1574-6968.2008.01286.x

24. Евдокимова, О. В. Идентификация бактерий Bacillus pumilus с помощью видоспецифичной ПЦР / О. В. Евдокимова, В. Е. Мямин, Л. Н. Валентович // Молекулярная и прикладная генетика : сб. науч. тр. / Ин-т генетики и цитологии Нац. акад. наук Беларуси. – Минск, 2016. – Т. 21. – С. 53–63.

25. Lee, H.-J. Multiplex PCR-based detection and identification of Leuconostoc species / H.-J. Lee, S.-Y. Park, J. Kim // FEMS Microbiology Letters. – 2000. – Vol. 193, N 2. – P. 243–247. https://doi.org/10.1111/j.1574-6968.2000.tb09431.x

26. Specific detection of Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides with DNA primers identified by randomly amplified polymorphic DNA analysis / G. Moschetti [et al.] // Appl. a. Environmental Microbiology. – 2000. – Vol. 66, N 1. – P. 422–424. https://doi.org/10.1128/aem.66.1.422-424.2000

27. A rapid method for identification of typical Leuconostoc species by 16S rDNA PCR-RFLP analysis / J. Jang [et al.] // J. of Microbiol. Methods. – 2003. – Vol. 55, N 1. – P. 295–302. https://doi.org/10.1016/s0167-7012(03)00162-3

28. Bendimerad, N. Isolation, identification, and technological characterization of wild leuconostocs and lactococci for traditional Raib type milk fermentation / N. Bendimerad, M. Kihal, F. Berthier // Dairy Science a. Technology. – 2012. – Vol. 92, N 3. – P. 249–264. https://doi.org/10.1007/s13594-012-0063-8