vestiagИзвестия Национальной академии наук Беларуси. Серия аграрных наукProceedings of the National Academy of Sciences of Belarus. Agrarian Series1817-72041817-7239The Republican Unitary Enterprise Publishing House "Belaruskaya Navuka"10.29235/1817-7204-2020-58-2-244-256vestiag-495Research ArticleПЕРАПРАЦОЎКА І ЗАХАВАННЕ СЕЛЬСКАГАСПАДАРЧАЙ ПРАДУКЦЫІPROCESSING AND STORAGE OF AGRICULTURAL PRODUCTIONКонструирование специфичных праймеров для идентификации подвидов Leuconostoc mesenteroidesConstruction of specific primers for identification of Leuconostoc mesenteroides subspeciesБирюкЕ. Н.BirukA. M.

Бирюк Елена Николаевна – кандидат с.-х. наук, зав. лабораторией молекулярно-генетических и биохимических исследований отдела биотехнологий

Партизанский пр., 172, 220075, Минск

Alena M. Biruk - Ph.D. (Agricultural)

Partizanskiy av. 172, 220075, Minsk

biohimbel@rambler.ruФурикН. Н.FurikN. N.

Фурик Наталья Николаевна – кандидат технических наук, заместитель директора по научной работе

Партизанский пр., 172, 220075, Минск

Natallia N. Furik - Ph.D. (Engineering)

Partizanskiy av. 172, 220075, Minsk

furik_nn@tut.byТарашкевичЮ. С.TarashkevichYu. S.

Тарашкевич Юлия Станиславовна – аспирант, младший научный сотрудник лаборатории молекулярно-генетических и биохимических исследований отдела биотехнологий

пр-т Партизанский, 172, 220075, Минск

Yuliya S. Tarashkevich - Postgraduate Student

Partizanskiy av. 172, 220075, Minsk

julia10095@mail.ruСавельеваТ. А.SavelyevaT. A.

Савельева Тамара Александровна – кандидат ветеринарных наук, доцент, ученый секретарь

Партизанский пр., 172, 220075, Минск

Tamara A. Savelyeva - Ph.D. (Veterinary)

Partizanskiy av. 172, 220075, Minsk

t.savelyeva@tut.byИнститут мясо-молочной промышленности, Национальная академия наук БеларусиInstitute for the Meat and Dairy Industry, the National Academy of Sciences of Belarus202012052020582244256Copyright © Бирюк Е.Н., Фурик Н.Н., Тарашкевич Ю.С., Савельева Т.А., 20202020Бирюк Е.Н., Фурик Н.Н., Тарашкевич Ю.С., Савельева Т.А.Biruk A.M., Furik N.N., Tarashkevich Y.S., Savelyeva T.A.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://vestiagr.belnauka.by/jour/article/view/495

Бактерии р. Leuconostoc – важная в технологическом отношении группа молочнокислых бактерий, входящая в состав заквасочных культур для производства различных молочных продуктов. В молочной промышленности наибольшее значение имеют два вида: Leuconostoc lactis и Leuconostoc mesenteroides, они включают три подвида: dextranicum, mesenteroides, cremoris. Основная проблема идентификации представителей р. Leuconostoc состоит в том, что данные микроорганизмы часто могут быть ошибочно идентифицированы как энтерококки или лактобактерии. По сравнению с традиционными способами видовой детекции установление видовой принадлежности с помощью ПЦР отличается универсальностью, более глубоким уровнем видовой дифференциации, высокой воспроизводимостью и достоверностью. В статье представлены результаты конструирования праймеров, специфичных для бактерий Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides и Leuconostoc mesenteroides ssp. dextranicum. Специфичность разработанных праймеров подтверждена тестированием in silico с использованием доступных геномных последовательностей Leuconostoc mesenteroides и экспериментально с использованием образцов ДНК чистых культур Leuconostoc mesenteroides. С помощью разработанных праймеров установлена таксономическая принадлежность 5 изолятов лейконостоков, выделенных из природных образцов. Разработаны методические указания, регламентирующие процедуру определения таксономического положения бактерий р. Leuconostoc до подвида. Методические указания по идентификации лейконостоков будут использоваться в коллекциях промышленных микроорганизмов для точной идентификации депонируемых штаммов.

Bacteria p. Leuconostoc is a technologically important group of lactic acid bacteria that is part of starter cultures for production of various dairy products. Two species are most important in the dairy industry: Leuconostoc lactis and Leuconostoc mesenteroides, which includes three subspecies: dextranicum, mesenteroides and cremoris. The main problem of identifying representatives of the p. Leuconostoc that these microorganisms can often be misidentified as enterococci or lactobacilli. In comparison with traditional methods of species detection, the establishment of species identity using PCR is characterized by universality, a deeper level of species differentiation, high reproducibility and reliability. The article presents the results of designing specific primers for Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides and Leuconostoc mesenteroides ssp. dextranicum. The specificity of developed primers was confirmed by in silico testing using available Leuconostoc mesenteroides genomic sequences, and experimentally using DNA samples of Leuconostoc mesenteroides clear cultures. The taxonomic affiliation of 5 isolates of leuconostocci isolated from natural samples was established using the developed primers. Methodological Instructions have been developed that regulate the procedure for determining the taxonomic position of bacteria of genus Leuconostoc to a subspecies. Methodological guidelines for identification of leuconostocs will be used in collections of industrial microorganisms for the accurate identification of deposited strains.

молочнокислые бактериизаквасочные культурыLeuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroidesLeuconostoc mesenteroides ssp. dextranicumLeuconostoc mesenteroides ssp. cremorisДНКПЦРпраймерыдекстрансахаразаlactic acid bacteriastarter culturesLeuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroidesLeuconostoc mesenteroides ssp. dextranicumLeuconostoc mesenteroides ssp. cremorisDNAPCRprimersdextransucraseРабота выполнена в рамках Государственной программы научных исследований «Качество и эффективность агропромышленного производства», подпрограмма 3 «Продовольственная безопасность».The research was carried out as part of the state program of scientific research “Quality and Efficiency of Agroindustrial Production”, subprogram 3 “Food security”.ReferencesХусаинов, И. А. Современные представления о биосинтезе бактериальных экзополисахаридов / И. А. Хусаинов // Вестн. Казан. технол. ун-та. – 2014. – Т. 17, № 5. – С. 167–172.Khusainov I. A. Current ideas about the biosynthesis of bacterial exopolysaccharides. Vestnik Kazanskogo tekhnologicheskogo universiteta [Bulletin of the Kazan Technological University], 2014, vol. 17, no. 5, pp. 167-172 (in Russian).Степаненко, П. П. Микробиология молока и молочных продуктов / П. П. Степаненко – Сергиев Посад : Все для Вас – Подмосковье, 1999. – 415 с.Stepanenko P. P. Microbiology of milk and dairy products. Sergiev Posad, Vse dlya Vas - Podmoskov’e Publ., 1999. 415 p (in Russian).Bergey’s manual of systematic bacteriology. – 2 nd ed. – New York : Springer, 2012. – Vol. 5 : The Actinobacteria / ed.: W. Whitman [et al.]. – 2083 p. https://doi.org/10.1007/978-0-387-68233-4.Whitman W., Goodfellow M., Kämpfer P., Busse H.-J., Trujillo M., Ludwig W., Suzuki K.-I. (eds.). Bergey’s manual of systematic bacteriology. Vol. 5. The Actinobacteria. 2nd ed. New York, Springer, 2012. 2083 p. https://doi.org/10.1007/978-0-387-68233-4Rosi, N. L. Nanostructures in biodiagnostics / N. L. Rosi, C. A. Mirkin // Chem. Rev. – 2005. – Vol. 105, N 4. – P. 1547– 1562. https://doi.org/10.1021/cr030067fRosi N. L., Mirkin C. A. Nanostructures in biodiagnostics. Chemical Reviews, 2005, vol. 105, no. 4, pp. 1547-1562. https://doi.org/10.1021/cr030067fThe atmospheric and room-temperature plasma (ARTP) method on the dextranase activity and structure / X. Wang [et al.] // Intern. J. of Biol. Macromolecules. – 2014. – Vol. 70 – P. 284 –291. https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2014.07.006Wang X., Lu M., Wang S., Fang Y., Wang D., Ren W., Zhao G. The atmospheric and room-temperature plasma (ARTP) method on the dextranase activity and structure. International Journal of Biological Macromolecules, 2014, vol. 70, pp. 284-291. https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2014.07.006Otts, D. R. Dextransucrase secretion in Leuconostoc mesenteroides depends on the presence of a transmembrane proton gradient / D. R. Otts, D. F. Day // J. of Bacteriology. – 1988. – Vol. 170, N 11. – P. 5006–5011. https://doi.org/10.1128/jb.170.11.5006-5011.1988Otts D. R., Day D. F. Dextransucrase secretion in Leuconostoc mesenteroides depends on the presence of a transmembrane proton gradient. Journal of Bacteriology, 1988, vol. 170, no. 11, pp. 5006-5011. https://doi.org/10.1128/jb.170.11.5006-5011.1988Erten, H. Fermentation of glucose and fructose by Leuconostoc mesenteroides / H. Erten // Tur. J. of Agriculture a. Forestry. – 2000. – Vol. 24, № 4. – P. 527–532.Erten H. Fermentation of glucose and fructose by Leuconostoc mesenteroides. Turkish Journal of Agriculture and Forestry, 2000, vol. 24, no. 4, pp. 527-532.Гудков, А. В. Сыроделие: технологические, биологические и физико-химические аспекты / А. В. Гудков ; под ред. С. А. Гудкова. – М. : ДеЛи принт, 2003. – 799 с.Gudkov A. V. Cheese making: technological, biological and physico-chemical aspects. Moscow, DeLi print Publ., 2003. 799 p. (in Russian).Carbon dioxide production by Leuconostoc mesenteroides grown in single and mixed culture with Lactococcus lactis in skimmed milk / M. Kihal [et al.] // World J. of Dairy a. Food Sciences. – 2007. – Vol. 2, N 2. – P. 62–68.Kihal M., Prevost H., Henni D. E., Benmechernene Z., Diviès C. Carbon dioxide production by Leuconostoc mesenteroides grown in single and mixed culture with Lactococcus lactis in skimmed milk. World Journal of Dairy and Food Sciences, 2007, vol. 2, no. 2, pp. 62-68.Шергин, Н. А. Улучшение качества сыров группы голландского путем совершенствования отбора лейконостоков в закваски : дис. ... канд. тех. наук : 05.18.04 / Н. А. Шергин. – Углич, 1985. – 246 л.Shergin N. A. Improving the quality of Dutch-type cheeses by improving the selection of Leuconostoc in starter cultures. Ph.D. Thesis. Uglich, 1985. 246 p. (in Russian).Dundar, H. Purification and characterization of a bacteriocin from an oenological strain of Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris / H. Dundar, B. Salih, F. Bozoğlu // Preparative Biochemistry a. Biotechnology. – 2016. – Vol. 46, N 4. – P. 354–359. https://doi.org/10.1080/10826068.2015.1031395Dundar H., Salih B., Bozoğlu F. Purification and characterization of a bacteriocin from an oenological strain of Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris. Preparative Biochemistry and Biotechnology, 2016, vol. 46, no. 4, pp. 354-359. https://doi.org/10.1080/10826068.2015.1031395Characterization and purification of mesentericin Y105, an anti-Listeria bacteriocin from Leuconostoc mesenteroides / Y. Hechard [et al.] // J. of General Microbiology. – 1992. – Vol. 138, N 12. – P. 2725 –2731. https://doi.org/10.1099/00221287-138-12-2725Hechard Y., Derijard B., Letellier F., Cenatiempo Y. Characterization and purification of mesentericin Y105, an anti-Listeria bacteriocin from Leuconostoc mesenteroides. Journal of General Microbiology, 1992, vol. 138, no. 12, pp. 2725-2731. https://doi.org/10.1099/00221287-138-12-2725Aziz, R. A. Antibacterial effect of bacteriocin from Leuconostoc mesenteroides ssp. cremoris against diarrheal causative bacteria / R. A. Aziz, J. A. S. Salman, O. A. H. Hachim // ‏Europ. J. of Biomed. a. Pharmaceutical Sciences. – 2016. – Vol. 3, N 11. – P. 114–118.Aziz R. A., Salman J. A. S., Hachim O. A. H. Antibacterial effect of bacteriocin from Leuconostoc mesenteroides ssp. cremoris against diarrheal causative bacteria. European Journal of Biomedical and Pharmaceutical Sciences, 2016, vol. 3, no. 11, pp. 114-118.Сорокина, Н. П. Производство ферментированных молочных продуктов и сыров: состав и свойства заквасочной микрофлоры / Н. П. Сорокина, И. В. Кучеренко // Молоч. пром-сть. – 2013. – № 6. – С. 38–40.Sorokina N. P., Kucherenko I. V. Production of fermented milk products and cheeses: composition and properties of starters microflora. Molochnaya promyshlennost’ = Dairy Industry, 2013, no. 6, pp. 38–40 (in Russian).Сорокина, Н. П. Бактериальные закваски для производства сыров / Н. П. Сорокина, Е. В. Кураева, И. В. Кучеренко // Сыроделие и маслоделие. – 2016. – № 4. – С. 26–31.Sorokina N. P., Kuraeva E. V., Kucherenko I. V. Bacterial starters for cheese production. Syrodelie i maslodelie = Cheesemaking and Oilmaking, 2016, no. 4, pp. 26-31 (in Russian).Биологические свойства лактобацилл. Перспективы использования в лабораториях Роспотребнадзора экспресс-методов амплификации нуклеиновых кислот (МАНК) при контроле качества пищевых продуктов, БАД к пище, лекарственных форм, содержащих лактобациллы / И. В. Соловьева [и др.] // МедиАль. – 2014. – № 2 (12). – С. 29–44.Solov’eva I. V., Tochilina A. G., Belova I. V., Novikova N. A., Ivanova T. P. The lactobacillus biological properties. Prospects of express-methods nucleic acid amplification for the foods, food supplements and drugs on its basis quality control. MediAl’ = MediAl, 2014, no. 2 (12), pp. 29-44 (in Russian).Точилина, А. Г. Биохимическая и молекулярно-генетическая идентификация бактерий рода Lactobacillus : дис. … канд. биол. наук : 03.00.04 ; 03.00.07 / А. Г. Точилина. – Н. Новгород, 2009. – 148 л.Tochilina A. G. Biochemical and molecular genetic identification of bacteria of Lactobacillus genus. Ph.D. Thesis. Nizhny Novgorod, 2009. 148 p. (in Russian).Chentouf, H. F. Isolation and identification of Leuconostoc mesenteroides producing bacteriocin isolated from Algerian raw camel milk / H. F. Chentouf, B. Zineb // Afr. J. of Microbiology Research. – 2013. – Vol. 7, N 23. – P. 2961–2969. https://doi.org/10.5897/ajmr2013.5753Chentouf H. F., Zineb B. Isolation and identification of Leuconostoc mesenteroides producing bacteriocin isolated from Algerian raw camel milk. African Journal of Microbiology Research, 2013, vol. 7, no. 23, pp. 2961-2969. https://doi.org/10.5897/ajmr2013.5753Dimic, G. Characteristics of the Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides strains from fresh vegetables / G. Dimic // Acta Periodica Technologica. – 2006. – N 37. – P. 3–11. https://doi.org/10.2298/apt0637003dDimic G. Characteristics of the Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides strains from fresh vegetables. Acta Periodica Technologica, 2006, no. 37, pp. 3-11. https://doi.org/10.2298/apt0637003dDe Man, J. C. A medium for the cultivation of Lactobacilli / J. C. De Man, M. Rogosa, M. E. Sharpe // J. of Appl. Bacteriology. – 1960. – Vol. 23, N 1. – P. 130–135. https://doi.org/10.1111/j.1365-2672.1960.tb00188.xDe Man J. C., Rogosa M., Sharpe M. E. A medium for the cultivation of Lactobacilli. Journal of Applied Bacteriology, 1960, vol. 23, no. 1, pp. 130-135. https://doi.org/10.1111/j.1365-2672.1960.tb00188.xLength and sequence heterogeneity in 5S rDNA of Populus deltoides / M. S. Negi [et al.] // Genome. – 2002. – Vol. 45, N 6. – P. 1181–1188. https://doi.org/10.1139/g02-094Negi M. S., Rajagopal J., Chauhan N., Cronn R., Lakshmikumaran M. Length and sequence heterogeneity in 5S rDNA of Populus deltoides. Genome, 2002, vol. 45, no. 6, pp. 1181-1188. https://doi.org/10.1139/g02-094Marmiroli, N. Advanced PCR techniques in identifying food components / N. Marmiroli, C. Peano, E. Maestri // Food authenticity and traceability / ed. M. Lees. – Boca Raton ; Cambridge, 2003. – P. 3–33. https://doi.org/10.1533/9781855737181.1.3Marmiroli N., Peano C., Maestri E. Advanced PCR techniques in identifying food components. Food authenticity and traceability. Boca Raton, Cambridge, 2003, pp. 3-33. https://doi.org/10.1533/9781855737181.1.3A genus-specific PCR method for differentiation between Leuconostoc and Weissella and its application in identification of heterofermentative lactic acid bacteria from coffee fermentation / U. Schillinger [et al.] // FEMS Microbiology Letters. – 2008. – Vol. 286, N 2. – P. 222–226. https://doi.org/10.1111/j.1574-6968.2008.01286.xSchillinger U., Böhringer B., Wallbaum C., Caroline L., Gonfa A., Huch M., Holzapfel W. H., Franz C. M. A. P. A genus-specific PCR method for differentiation between Leuconostoc and Weissella and its application in identification of heterofermentative lactic acid bacteria from coffee fermentation. FEMS Microbiology Letters, 2008, vol. 286, no. 2, pp. 222-226. https://doi.org/10.1111/j.1574-6968.2008.01286.xЕвдокимова, О. В. Идентификация бактерий Bacillus pumilus с помощью видоспецифичной ПЦР / О. В. Евдокимова, В. Е. Мямин, Л. Н. Валентович // Молекулярная и прикладная генетика : сб. науч. тр. / Ин-т генетики и цитологии Нац. акад. наук Беларуси. – Минск, 2016. – Т. 21. – С. 53–63.Evdokimova O. V., Myamin V. E., Valentovich L. N. Identification of Bacillus pumilus bacteria by using species-specific PCR assay. Molekulyarnaya i prikladnaya genetika: sbornik nauchnykh trudov [Molecular and Applied Genetics: a collection of scientific papers]. Minsk, 2016, vol. 21, pp. 53-63 (in Russian).Lee, H.-J. Multiplex PCR-based detection and identification of Leuconostoc species / H.-J. Lee, S.-Y. Park, J. Kim // FEMS Microbiology Letters. – 2000. – Vol. 193, N 2. – P. 243–247. https://doi.org/10.1111/j.1574-6968.2000.tb09431.xLee H.-J., Park S.-Y., Kim J. Multiplex PCR-based detection and identification of Leuconostoc species. FEMS Microbiology Letters, 2000, vol. 193, no. 2, pp. 243-247. https://doi.org/10.1111/j.1574-6968.2000.tb09431.xSpecific detection of Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides with DNA primers identified by randomly amplified polymorphic DNA analysis / G. Moschetti [et al.] // Appl. a. Environmental Microbiology. – 2000. – Vol. 66, N 1. – P. 422–424. https://doi.org/10.1128/aem.66.1.422-424.2000Moschetti G., Blaiotta G., Villani F., Coppola S. Specific detection of Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides with DNA primers identified by randomly amplified polymorphic DNA analysis. Applied and Environmental Microbiology, 2000, vol. 66, no. 1, pp. 422-424. https://doi.org/10.1128/aem.66.1.422-424.2000A rapid method for identification of typical Leuconostoc species by 16S rDNA PCR-RFLP analysis / J. Jang [et al.] // J. of Microbiol. Methods. – 2003. – Vol. 55, N 1. – P. 295–302. https://doi.org/10.1016/s0167-7012(03)00162-3Jang J., Kim B., Lee J., Han H. A rapid method for identification of typical Leuconostoc species by 16S rDNA PCR-RFLP analysis. Journal of Microbiological Methods, 2003, vol. 55, no. 1, pp. 295-302. https://doi.org/10.1016/s0167-7012(03)00162-3Bendimerad, N. Isolation, identification, and technological characterization of wild leuconostocs and lactococci for traditional Raib type milk fermentation / N. Bendimerad, M. Kihal, F. Berthier // Dairy Science a. Technology. – 2012. – Vol. 92, N 3. – P. 249–264. https://doi.org/10.1007/s13594-012-0063-8Bendimerad N., Kihal M., Berthier F. Isolation, identification, and technological characterization of wild leuconostocs and lactococci for traditional Raib type milk fermentation. Dairy Science and Technology, 2012, vol. 92, no. 3, pp. 249-264. https://doi.org/10.1007/s13594-012-0063-8

The authors declare that there are no conflicts of interest present.